Dopo la perfusione crioprotettiva, un paziente non viene semplicemente immerso nell’azoto liquido.
Il paziente segue un programma di raffreddamento controllato dal computer che dura diversi giorni. I sensori all’interno del paziente mostrano se le diverse regioni anatomiche si stanno raffreddando insieme o se si stanno separando in pericolosi gradienti termici.
Il problema ingegneristico cambia durante la discesa. Il raffreddamento iniziale dovrebbe limitare la formazione di ghiaccio. Vicino e al di sotto della transizione vetrosa, la precisione e l’uniformità termica diventano più importanti della velocità.
Perché il raffreddamento controllato è necessario
Gli agenti crioprotettivi riducono la velocità di raffreddamento necessaria per evitare la formazione di ghiaccio. Permettono ai tessuti ricchi di acqua di entrare in uno stato altamente viscoso, simile al vetro, invece di cristallizzare in modo esteso.
La temperatura di transizione vetrosa rilevante, indicata come Tg, dipende dalla soluzione, dalla sua concentrazione e dal metodo di misurazione. È un intervallo, non una singola soglia biologica universale.
Per le soluzioni rilevanti per la criopreservazione umana, questa regione si trova comunemente vicino a -120°C a -135°C.
Sopra questa regione, raffreddare troppo lentamente può consentire la nucleazione e la crescita del ghiaccio. Al di sotto, il materiale si comporta sempre più come un solido fragile.
Se la superficie si raffredda molto più velocemente del centro, diverse regioni si contraggono in misura diversa. Lo stress termomeccanico risultante può provocare crepe.
Questo crea un percorso vincolato: raffreddare abbastanza rapidamente prima della vetrificazione, poi controllare i gradienti e la velocità di raffreddamento mentre il paziente diventa simile al vetro.
Vedila differenza tra congelamento e vetrificazione per il comportamento di fase sottostante.
La prima scatola di raffreddamento di prima generazione
Il primo sistema di raffreddamento di prima generazione di Tomorrow.bio, chiamato V1 cooling box, ha stabilito l’architettura di base per il raffreddamento controllato dell’intero corpo.
Il paziente viene posizionato all’interno di una camera isolata dedicata. Un computer controlla l’ambiente criogenico della camera mentre i termocoppie misurano le temperature in più punti.
Il controller segue una curva programmata piuttosto che applicare un raffreddamento massimo in modo continuo. Ogni canale del sensore viene registrato come parte della storia termica del paziente.
Questo è già fondamentalmente diverso dall’immersione diretta. La macchina può rallentare, mantenere o modificare le condizioni della camera in risposta a ciò che sta effettivamente accadendo al paziente.
Il sistema di seconda generazione basato su dewar
Il design di seconda generazione di Tomorrow.bio sposta il raffreddamento controllato in un dewar costruito appositamente.
Il paziente rimane all'interno del dewar mentre un coperchio specializzato integra l'hardware di raffreddamento, i controlli del computer, le valvole, le connessioni dei sensori e i passaggi per termocoppie.
Le termocoppie sono posizionate in diversi punti all'interno del paziente. Sensori aggiuntivi monitorano l'ambiente termico all'interno del dewar.
Il sistema quindi rileva più del setpoint richiesto. Rileva quanto velocemente le diverse aree misurate del paziente stanno rispondendo.
Il computer regola il gradiente di temperatura del dewar e la velocità di discesa per mantenere quelle letture all'interno dell'inviluppo consentito dal protocollo.
Un corpo grande non può essere perfettamente isotermo durante il raffreddamento. L'obiettivo pratico è minimizzare la dispersione e impedire che qualsiasi area misurata proceda pericolosamente più velocemente o più lentamente.
La geometria del dewar riduce anche la manipolazione tra raffreddamento controllato e stoccaggio criogenico. La stessa forma chiusa può fornire un ambiente stabile e simmetrico intorno al paziente.
La temperatura di setpoint non è la temperatura del paziente
Un controller può rendere l'ambiente freddo rapidamente. Non può rendere istantaneamente il centro di un corpo umano corrispondente a quella temperatura.
Il calore deve viaggiare dai tessuti più profondi verso la superficie. La geometria, la composizione corporea, la distribuzione del crioprotettore e la posizione dei sensori influenzano il ritardo osservato.
Ecco perché un solo sensore nella camera è insufficiente. Un ambiente -130°C nominale non prova che ogni parte misurata del paziente abbia raggiunto -130°C.
Il sistema di controllo deve considerare sia la temperatura assoluta che la differenza tra i canali. Il punto più lento, quello più veloce e la dispersione complessiva forniscono ciascuno informazioni.
Anche la calibrazione, il posizionamento e la continuità delle termocoppie contano. Letture implausibili o guasti ai sensori devono essere segnalati piuttosto che essere mediati silenziosamente nella curva.
Il programma di temperatura a tre fasi di Tomorrow.bio
Il protocollo attuale ha tre fasi distinte. I valori sono obiettivi operativi per questa apparecchiatura e per l'approccio crioprotettivo, non costanti universali per ogni sistema di vitrificazione.
1. Scendere rapidamente verso -130°C
La prima fase sposta il paziente dalla temperatura del ghiaccio secco verso circa -130°C il più velocemente possibile, nei limiti di sicurezza consentiti dalla dispersione della temperatura misurata.
La velocità conta qui perché le regioni non protette possono ancora formare ghiaccio prima che il tessuto diventi simile al vetro.
Il computer non si basa solo sul tempo trascorso. Monitora le termocoppie e regola l'ambiente di raffreddamento intorno al paziente.
2. Consentire un rimbalzo controllato verso -120°C
Dopo aver raggiunto circa -130°C, il raffreddamento attivo viene ridotto e al paziente è permesso di riscaldarsi naturalmente fino a circa -120°C.
Questa è una fase di annealing. Vicino a Tg, il materiale crioprotetto conserva sufficiente mobilità molecolare perché parte dello stress meccanico accumulato possa rilassarsi.
Il rimbalzo dà anche alle regioni più calde e più fredde il tempo di avvicinarsi tra loro prima che il materiale venga portato più in profondità nel suo stato rigido vetroso.
L’annealing non inverte i danni biologici preesistenti. Il suo scopo è più limitato: ridurre i gradienti termici e gli stress creati da un’irregolare contrazione.
3. Scendi a -196°C a circa 1°C per ora
Da circa -120°C, l’obiettivo di discesa è circa 1°C per ora finché il paziente non raggiunge la temperatura dell’azoto liquido.
Quell’intervallo finale di 76 gradi richiede circa tre giorni anche prima di contare le soste e le regolazioni del controllo.
Mantenere 1°C per ora in un corpo grande e termicamente eterogeneo è un problema di controllo, non solo un’impostazione del timer.
Il controller deve regolare continuamente l’ambiente del dewar in modo che i termocoppie interne scendano insieme senza creare gradienti eccessivi.
Quando una regione rimane indietro, forzare l’ambiente a raffreddarsi ulteriormente può raffreddare troppo un’altra regione. La precisione significa bilanciare l’intero campo dei sensori, non inseguire una singola lettura.
Perché la fase di annealing è scientificamente plausibile
Le ricerche sulla vitrificazione su larga scala identificano due zone di fallimento concorrenti: un raffreddamento insufficiente sopra Tg e uno stress meccanico eccessivo intorno e sotto Tg.
Uno2024 studio di vitrificazione su scala di organo umano ha usato più sonde interne e concluso che l’annealing riduce i gradienti prima che il materiale entri nella fase vetrosa.
Lo stesso studio ha rilevato che un raffreddamento lento sotto la regione di annealing aiuta a evitare di ricostruire grandi gradienti e stress.
Separate ricerchetermo-meccaniche hanno scoperto che l’annealing vicino a Tg cambia sostanzialmente lo stress residuo e ne indebolisce la dipendenza dal tasso di raffreddamento precedente.
Questi studi supportano la strategia di controllo sottostante. Non validano indipendentemente ogni singolo valore di setpoint nel protocollo di corpo intero di Tomorrow.bio.
I corpi umani interi sono più grandi e eterogenei delle soluzioni di laboratorio o degli organi. Rimangono necessari registri diretti della temperatura e immagini post-raffreddamento.
Quello che registra il computer
L'output utile non è un messaggio che dice 'raffreddamento completato'. È la serie temporale completa da ogni canale di temperatura.
Il registro dovrebbe mostrare velocità, soste, rimbalzi, gradienti tra sensori, azioni del controller, allarmi e qualsiasi deviazione dalla curva pianificata.
Questi dati diventano parte dellavalutazione della qualità della criopreservazione.
Dopo il raffreddamento, una TAC standardizzata a temperatura dell'azoto liquido può rilevare la distribuzione del crioprotettore, il ghiaccio, deformazioni gravi e fratture che i dati di temperatura da soli non possono rivelare.
Perché terminare a temperatura dell'azoto liquido
A pressione atmosferica normale, l'azoto bolle vicino a 77.34 kelvin, circa -195.8°C, secondo ilNIST Chemistry WebBook.
La conservazione in azoto liquido è passiva. Finché nel contenitore rimane una quantità sufficiente di liquido, il suo equilibrio di ebollizione mantiene un ambiente criogenico stabile senza refrigerazione meccanica.
La discesa controllata termina solo quando il paziente è termicamente pronto per quello stato stabile. La conservazione non viene usata come sostituto del raffreddamento.
La progettazione e i compromessi della fase successiva sono trattati indewar criogenici moderni e conservazione a temperatura intermedia.
In breve: Tomorrow.bio usa raffreddamento controllato dal computer e sensori di temperatura interni. Il processo raffredda rapidamente vicino alla formazione del vetro, allevia lo stress termico, poi scende lentamente verso -196°C.
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